Feeder 构建

谱新生物基于NK细胞、TIL、γδT细胞的独特特性，对K562细胞进行了精准基因改造，主要通过引入膜结合白介素因子、优选免疫刺激分子，并对抗原特异性基因进行了改造。这些改造旨在：

·诱导活化功能：选择能维持记忆性T细胞且不会引起T细胞凋亡的白介素因子，并通过设计膜结合型白介素因子，以克服分泌型因子血清半衰期短的缺点，从而更有效地诱导和维持T细胞、B细胞和NK细胞的增殖与分化；

·共刺激信号选择：优选与活化的CD4+和CD8+ T细胞及NK细胞高表达受体相结合的免疫刺激分子，通过提供共刺激信号，显著促进T细胞或NK细胞的体外扩增，为细胞药物的制备提供高质量的细胞源；

·抗原特异性改造：针对K562细胞表面可能引起免疫细胞优势生长的Marker进行基因改造，避免了对细胞一致性的影响，从而提高了细胞药物CMC部分的质量可控性，并在临床阶段保证了稳定的疗效。这一改造也凸显了K562细胞作为Feeder细胞相较于PBMC的优势。

生产工艺

在成功建立主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）后，谱新生物对培养体系、辐照条件、制剂配方以及冻存条件等方面进行了全面的工艺开发，确保在工艺锁定后能够实现高效、稳定的工艺放大及GMP中试生产。整个生产流程严格遵守GMP标准，确保每批次生产的基因改造K562 Feeder cell均达到高质量标准，无外源因子污染。

功能验证

在谱新NK/CAR-NK细胞生产工艺中，即使采用不同Donor，谱新滋养层细胞均能有效支持NK细胞在15天内实现四万倍的扩增，且终产品的细胞活率均超过90% （如图4所示）

不同Donor来源NK细胞扩增倍数和活率

不同Donor来源的NK细胞纯度

安全性评价

细胞来源清晰明确，具备完整的可追溯性。每一个改造的K562细胞都经过了可追溯的、完整的单克隆筛选过程记录。经过严格的功能验证后，这些细胞会进入主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）的建库流程。在库检定环节，谱新生物严格遵循2020年版《中国药典》和《美国药典》（USP）的要求，进行全面而细致的检定。

对于基因改造后的K562细胞，谱新生物实施了一系列严格的检定措施，包括基因插入位点、转基因元件拷贝数、转基因表达等关键指标的检测，以确保其质量符合既定的标准和要求。此外，为了深入研究HiCellx®-Feeder的增殖和残留情况，谱新生物对每批次HiCellx®-Feeder 进行培养，并实时监测其生长和DNA合成速率。

基于先进的HiLenti®悬浮无血清慢病毒技术平台和HiCellx®-Feeder 滋养层细胞平台，结合无血清和封闭模块化的先进生产体系，谱新NK/CAR-NK细胞平台工艺能够高效地制备出高纯度的NK细胞。这些NK细胞的终产品中CAR阳性率可达到70%以上，同时滋养层细胞的残留量低于0.1%，符合监管要求。